iMuSCs, #9(2)

Methods, part2
In vitro differentiation
In vitro embryoid body (EB) formation of iMuSCs was induced by applying the routinely used ‘hanging-drop’ technique6,16. Single cell suspensions of iMuSCs (3.75 × 104 cells/ml) were placed as 20 μl micro-drops of ESGRO Complete PLUS Clonal Grade Medium (Millipore, USA) on the lids of 100 mm dishes. Bottom plates of the dishes were filled with sterile PBS to avoid desiccation of samples. Lids were then placed on the bottom plates for 4 days to achieve hanging drop cultures. During this time, single iMuSCs formed EBs, which were harvested and further cultured in suspension for 3 additional days. For spontaneous in vitro differentiation, EBs were cultured on collagen type IV-coated 24-well plates in EB Medium [DMEM supplemented with 20% FBS, 2 mM Glutamax, 1% non-essential amino acids, and 1% antibiotics; all from Gibco (USA)] for 2 weeks with medium changed every other day. Additionally, multiple differentiations of iMuSCs were assessed by myogenic and osteogenic differentiation assays following standard protocols.
Singe cell migration
Target cell populations and control cells (MuSCs and C2C12 cells) were plated separately on collagen type IV-coated 6-well plates, 10,000 cells/well, in growth medium, 48 hours prior to the time-lapse experiment. Time lapse images were acquired with an Andor IXon3 885 EMCCD camera (Andor, USA) on an Olympus IX-81 (Olympus, USA) microscope fitted with a microscope enclosure (Precision Plastics, USA), and images of single cell migration were taken for six hours at three minute intervals; three different fields/well were chosen for the recording. Proper environmental conditions were maintained in a micro incubator at 37 °C with 5% CO2. A series of images were analyzed using NIH ImageJ analysis software to track the centroid positions (x, y) of cell nuclei (which were assumed to be the representations of cell-bodies). Migration paths were plotted and analyzed by the Chemotaxis and Migration Tool v2.0 from Ibidi. Net translocation distance was measured as the distance between the starting point and the end point of cells after six hours. Migration speed was calculated as total length of the migration path during the six-hour period.
Immunohistochemistry
Samples were fixed with 4% paraformaldehyde (Sigma, USA) for 20 minutes at room temperature. After permeabilization with 0.2% Triton X-100 (Sigma, USA) for 30 minutes, nonspecific binding of antibodies was blocked for one hour with 10% BSA and 5% HS (Sigma, USA) in PBS, at room temperature. The primary antibodies (Supplementary Table 2) were applied overnight at 4 °C. After the overnight incubation, the cells were incubated for one hour at room temperature with the appropriate fluorescence-conjugated secondary antibodies (Extended Data Table 2). The nuclei were revealed using 4′, 6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining (Sigma, USA), and fluorescent microscopy (Nikon) was used to visualize the results. Quantitative image analysis was performed using the NIH ImageJ Software.
実験方法(2)
In vitroでの分化誘導
In vitroでのiMuSCs胚様体(EB)形成は、頻用されている「懸滴培養」技術を応用することにより誘導した。iMuSCs (3.75 × 104 cells/ml)単細胞浮遊液を、20μlずつ微小滴下し、ESGRO Complete PLUS Clonal Grade培養液(Millipore, USA) を満たしたmicro-drops100 mm培養皿の蓋に撒いた。サンプルの乾燥を避けるために培養皿の底部を滅菌PBSで満たした。懸滴培養を実施するため、培養皿の蓋部を4日間培養皿の底部の上に置いた。培養4日間で、単細胞iMuSCsは胚様体を形成した。それを回収し、さらに3日間、浮遊状態で培養を続けた。自発的in vitro分化誘導のため、胚様体は、EB用培養液[DMEMに添加20% FBS、2mMグルタミン酸、1%非必須アミノ酸及び1% 抗体;すべてGibco (USA)より購入]を用いて4型コラーゲンコーティング24穴培養プレートで2週間培養した。培養液は2日ごとに交換した。加えて、iMuSCsの多能性を検討するため、標準的なプロトコールに従って筋源性及び骨源性分化実験を行なった。
単細胞遊走能
標的細胞集団とコントロール細胞(MuSCs及びC2C12細胞)をそれぞれ10,000細胞数/ 穴の濃度で、4型コラーゲンコーティング6穴培養プレートに撒いた。低速度撮影に先立ち、成長培養液を用い48時間培養した。低速度撮影画像は、顕微鏡格納装置(Precision Plastics, USA)付きオリンパスIX-81(Olympus, USA)顕微鏡を装着したAndor IXon3 885 EMCCDカメラ(Andor, USA)から得た。単細胞遊走の画像は、3分間隔で6時間撮影した。1つのプレートのウエル(穴)当たり3つの異なるフィールドを記録用として選択した。適切な培養環境を維持するために、マイクロインキュベーター(培養器)は、37°C、5% CO2下で管理した。一連の画像は、NIH ImageJ解析ソフトウェアで分析し、細胞核の重心(細胞体の代表と仮定した)の位置 (x, y) を追跡した。遊走経路は、Ibidiから提供されたChemotaxis and Migration Tool v2.0にょって分析し、プロットした。正味の移動距離は、開始点から6時間後の終了点の距離として算出した。遊走スピードは6時間の全遊走距離として計算した。
免疫化学的検討
サンプルは4%ホルムアルデヒド (Sigma, USA)を用いて、20分間、室温で固定した。0.2%トリトンX-100 (Sigma, USA)で30分間透過処理後、10% BSAと5% HS (Sigma, USA) 添加PBSを用い室温で1時間、非特異的抗体を結合させた。一次抗体(補足テーブル2)は、4°Cで一晩反応させた。一晩放置した後、細胞は、蛍光抱合2次抗体を用いて室温で1時間反応させた。核は、4′, 6′-ジアミジノ-2-フェニールインドール(DAPI)(Sigma, USA) 染色法で染色し、蛍光顕微鏡((Nikon)のより画像を描出した。量的イメージ解析にはNIH ImageJ Softwareを使用した。